Revista Farmespaña Industrial - Especial Cannabis Medicinal

taminados con mohos o bacterias, pueden representar un problema grave para la salud. Según la Farmacopea Europea 10.0 (5.1.8. Calidad microbiológica de productos medi- cinales y extractos vegetales, 2019 6 ), existen criterios generales que deben verificarse para garantizar la calidad microbiológica de los medicamentos y extractos de origen ve- getal. Dependiendo de la vía de administra- ción, los microorganismos que deben estar ausentes varían, pero los criterios de acep- tación más relevantes son el recuento total de microorganismos aerobios y el recuento total combinado de levaduras y mohos, ade- más de bacterias específicas como Salmone- lla o Enterobacter . Este estudio se llevó a cabo a partir de una partida de cáñamo rico en cannabinoides que no fue secada de forma adecuada tras la cose- cha, lo que favoreció el crecimiento demohos y levaduras durante su almacenamiento. Ante la posibilidad de que los extractos obtenidos no cumplieran con los estándares microbio- lógicos exigidos, se evaluó en primer lugar la carga microbiana y el contenido de humedad de la biomasa. A continuación, se procedió a la extracción del aceite mediante distintas técnicas, incluyendo aquellas de uso más ex- tendido a nivel industrial, como la extracción con CO₂ supercrítico (CO 2 sc), la maceración con etanol y la extracción asistida por ultra- sonidos. Con fines comparativos, también se aplicó el método Soxhlet. Además, se analizó la calidad microbiológica de los extractos y su composición. Dado que la humedad del cáñamo era el problema princi- pal, se evaluó su impacto en un amplio rango de valores. Asimismo, se estudió la concentra- ción de cannabinoides, clorofilas, polifenoles y la capacidad antioxidante de los extractos, con el fin de determinar si la humedad inicial del cáñamo influía en estos parámetros. Finalmente, se analizó la reducción de la carga microbiana del cáñamo tras las extrac- ciones. La idea final era evaluar si el cáñamo exhausto podía considerarse una materia prima aprovechable para otros usos, en lu- gar de un residuo agrícola sin valor, y deter- minar cuál de las técnicas de extracción era la más adecuada para ese fin. Materiales ymetodología Se utilizó cáñamo industrial proporcionado por la empresa Good Earth (España). El ma- terial, previamente molido (2,5 ± 0,5mm), presentaba una humedad inicial del 5,3% ± 0,1%. Para estudiar el efecto de la hume- dad, se prepararon lotes con distintos con- tenidos de humedad (hasta 35%), mediante atomización controlada de agua. Se compararon cuatro técnicas de extrac- ción: 1) Maceración con etanol: 8:1 (v/m), 1 h, 25 °C, agitación a 200 rpm. 2) Extracción asistida por ultrasonidos: 8:1 (v/m), 3 min de sonicación a 25 J/mL. 3) Soxhlet con etanol: 20:1 (v/m), reflujo durante 4,5 h. 4) Extracción con CO₂ supercrítico: presión constante de 320 bar, temperaturas de 40 °C y 60 °C, flujo de CO₂ de 3 g/min, hasta un consumo total de 19 kg CO₂/kg cáñamo. El contenido de cannabinoides, polifeno- les, clorofilas y la capacidad antioxidante (DPPH) fueron determinados por el Cen- tro Tecnológico Nacional Agroalimentario (CTAEX) mediante métodos acreditados se- gún ISO 17025. La concentración total de clo- rofilas (clorofila a + b, C a+b ) se determinó en disoluciones metanólicas mediante espec- trofotometría, utilizando las absorbancias a 664 nm y 650 nm y aplicando la ecuación desarrollada por 7 . C a+b = 222A 664 – 985,5A 650 La carga microbiana del cáñamo y de los extractos se evaluó mediante siembra en placa en los siguientes medios: PCA (Agar Conteo en Placa) para el recuento total de bacterias aerobias mesófilas, VRBG (Agar Bilis Rojo Violeta con Glucosa) para la detec- ción de enterobacterias, y SB (Agar Sabou- raud con Cloranfenicol) para el recuento de mohos y levaduras. Los resultados se expresaron como unida- des formadoras de colonias por gramo (UF- C/g), y la eficacia de cada técnica se valoró mediante reducciones logarítmicas del re- cuento después de cada extracción (N 1 ) res- pecto al valor inicial (N 0 ) con una desviación promedio de ± 0,3 logs. Los rendimientos de extracción se expresa- ron en porcentaje en masa, calculados como la relación entre la masa de extracto obteni- do y la masa de cáñamo procesado. El error experimental asociado a estos datos fue, tí- picamente, del 3%. Resultados y discusión Análisis microbiológico del cáñamo tratado Al igual que en la mayoría de las hierbas y plantas, se detectó una biocontaminación muy elevada en el cáñamo de partida, gran parte de ella en forma de esporas, que son las más difíciles de inactivar 8 . Concretamen- te, los valores iniciales de carga microbiana del cáñamo fueron de N 0 en PCA = 2,1 10 6 UF- C/g (log N 0 = 6,3), N 0 en VRBG =1,0 10 6 UFC/g (log N 0 = 6,0) y N 0 en SB =1,9 10 5 UFC/g (log N 0 = 5,3). La Tabla 1 recoge la carga microbiana del cáñamo agotado tras las extracciones y el grado de inactivación conseguido. Como puede verse, la mayor inactivación micro- biana del cáñamo agotado se consiguió con las técnicas que utilizaron etanol como di- solvente: maceración (2,7 logs), ultrasonidos (2,6 logs) y Soxhlet (3,0 logs) por su capaci- dad antimicrobiana de amplio espectro. En las extracciones supercríticas realizadas a 320 bar, la reducción fue de 1,2 logs a 40 ºC Tabla 1. Contaminación del cáñamo después de las extracciones y grado de inactivación microbiana alcanzada. Tecnología de extracción PCA VRBG SB N 1 (UFC/g) log (N 1 /N 0 ) N 1 (UFC/g) log (N 1 /N 0 ) N 1 (UFC/g) log (N 1 /N 0 ) Soxhlet 1,9 E+03 -3,0 4,9 E+00 -5,3 4,9 E+00 -4,6 Maceración 4,1 E+03 -2,7 5,6 E+02 -3,3 2,0 E+02 -3,0 Ultrasonidos 5,6 E+03 -2,6 5,6 E+02 -3,3 1,5 E+03 -2,1 CO 2 sc a 40 ºC 1,5 E+03 -1,2 0 -6,0 0 -5,3 CO 2 sc a 60 ºC 5,8 E+03 -2,6 0 -6,0 0 -5,3 INVESTIGACIÓN 33 FARMESPAÑA INDUSTRIAL · ESPECIAL CANNABIS MEDICAL